快速筛选高浓度生物药物的热稳定性

关键词:差示扫描量热法、高通量热稳定性筛选、短期热稳定性

MC177-CN

摘要

生物治疗药物的热稳定性测试对于确保产品质量和支持生物药品的监管审批至关重要。TA Instruments™ RS-DSC (快速筛选差示扫描量热仪) 提供了一个可同时分析多达 24 个样品的平台。此外,还可使用低容量一次性微流控芯片对高浓度蛋白质候选药物进行评估。本应用说明提供了评估检测极限以及证明适用于差示扫描量热仪 (DSC) 分析的浓度范围的数据,以说明 TA Instruments RS-DSC 的实用性。

前言

短期热稳定性测试对于评估化合物的热应力耐受性至关重要,而热应力耐受性是预测保质期和保持功效的关键。差示扫描量热法 (DSC) 是一种用于了解抗体结构的技术;但传统仪器很难表征配方浓度的样品。这些挑战源于使用不可替换的样品池,因此必须进行冗长的清洁步骤以防止扫描之间的样品残留。固定的样品池还限制了浓度上限,因为高浓度蛋白质在加热时更有可能堵塞样品池。在最好的情况下,堵塞的样品池需要广泛且严格的清洗才能再生。在最糟糕的情况下,样品池可能会受到不可逆转的污染。因此,需要对其配方浓度的样品进行稀释。浓度会影响蛋白质的热稳定性,因此要准确了解潜在药物在储存条件下的蛋白质稳定性,需要对配方强度的样品进行测试。

TA Instruments RS-DSC 是差示扫描微量热技术的一次创新性飞跃。与其他 DSC 不同,TA Instruments RS-DSC 无需稀释样品,因为它经过独特设计,可在低容量和一次性微流控芯片中处理高浓度生物药物制剂。该技术集成消除了在各个运行之间重复清洁仪器的测量样品池的需要,节省了时间并降低了污染风险,同时可实现更可靠的数据读取。样品的制备、密封和分析准备可在一分钟内完成,只需极少量的样品即可进行精确评估。 TA Instruments RS-DSC 通过同时分析 24 个样品重新定义了热稳定性测试领域,是生物制药行业高通量热稳定性测试的全新平台。通过热分析提供全面的理化见解可加快药品的开发,进而可高效地将药品推向市场。

Figure 1. A) TA Instruments RS-DSC. B) Sample is prepared by pipetting protein solution into MFC and sealing with a glass cover slip.
Figure 1. A) TA Instruments RS-DSC. B) Sample is prepared by pipetting protein solution into MFC and sealing with a glass cover slip.

实验和方法

按照包装说明在组氨酸制剂缓冲液 (18.4 mg/mL 二水海藻糖、0.08 mg/mL 聚山梨酯 20、0.49 mg/mL 组氨酸 HCl、0.32 mg/mL 组氨酸,pH 6.0) 中制备 Herceptin® 曲妥珠单抗 (Trastuzumab),浓度为 21 mg/mL,并在使用前在 4 °C 保存。在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中分析时,使用 Amicon™ Ultra 10kDa 截留分子量离心过滤器将抗体缓冲液交换为由 Gibco™ DPBS 和 1 mM EDTA ( pH 7.4) 组成的 PBS,调整至所需浓度,一式三份进行检测。

用于评估高浓度蛋白质溶液的鸡蛋清溶菌酶购自 Sigma Aldrich (L6876),并在甘氨酸缓冲液 (0.1 M 甘氨酸,pH 2.5) 中配制。使用 Amicon Ultra 3kDa 分子量截止离心过滤器将蛋白质样品浓缩至 330 mg/mL。由浓缩溶液制备稀释样品。制备蛋白质浓度后,立即在 TA Instruments RS-DSC 上进行一式三份的实验。

直接将蛋白质样品加入一次性玻璃微流控芯片 (MFC) 中,该芯片的通道可容纳 11 μL 液体样品。加入蛋白质溶液后,用背胶玻璃盖玻片密封 MFC,以在加热至 100 °C 期间容纳样品,并准备将其放入 TA Instruments RS-DSC 中 (图 1)。将组装好的 MFC 放置在每个双量热仪的样品侧。将可重复使用的聚醚醚酮 (PEEK) 芯片保留在参考侧。最多可同时运行 24 个样品,最大温度范围为 20 – 100 °C,预设扫描速率为 1 或 2 °C/分钟。由于无需在扫描之间进行清洁,因此在一个典型工作日内最多可运行 96 个样品。

使用由 TA Instruments RSDSCRun 软件操作的 TA Instruments RS-DSC 时,每次扫描开始前都要在初始温度下平衡 1800 秒。每个样品一式三份,并在整个温度范围 (20 至 100 °C) 内以 1 或 2 °C/分钟的速度进行扫描。

为确保所有 24 个量热仪的准确性,首先使用二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC) 对仪器进行校准和验证,每台量热仪可接受的 Tmax 与预期文献值[1]的偏移应小于 0.2 °C。

使用 NanoAnalyze™ 软件 (v4.0.0) 处理数据。软件的新功能可以自动检测变性中点温度 (Tmax),并可对多达 96 个热分析图进行比较。NanoAnalyze 软件 v4.0.0 包括一种新的软件算法 RapidDSC,它将通过搜索指定数据范围内的峰值来自动检测 DSC 热分析图中的 Tmax。将自动基线应用于整个波峰,并用于进一步细化 Tmax 温度以提高准确性。自动波峰检测功能可在感兴趣温度范围内显示多达三个波峰。可在“基线和 Tmax 编辑器”弹出窗口中轻松编辑自动化功能,以缩小检测窗口、选择波峰识别的特定范围或调整自动基线和 Tmax。可导出 Tmax 自动化表格数据以方便比较,也可以在 RapidDSC 的 Tmax 可视化和叠加选项卡中查看。

结果和讨论

TA Instruments RS-DSC 的检测限

由于样品量要求较低,了解数据灵敏度和准确性所需的浓度限值非常重要。 更快的扫描速率可提高信号强度,有助于分析检测限浓度或接近检测限浓度的蛋白质浓度。为了解多转变蛋白的浓度要求,将抗体 Herceptin 曲妥珠单抗在 PBS 中调整为不同浓度,并以 2 °C/分钟的扫描速率对其进行一式三份的评估 (图 2 和表 1)。

Figure 2. Representative DSC scans of Herceptin Trastuzumab (0.06 mg – 1.1 mg per scan), collected in triplicate at 2 °C/min and normalized to molar heat capacity for direct comparison.
Figure 2. Representative DSC scans of Herceptin Trastuzumab (0.06 mg – 1.1 mg per scan), collected in triplicate at 2 °C/min and normalized to molar heat capacity for direct comparison.

表 1. 转变温度和检测限筛选重现性。平均值 ± SD,n = 3。

浓度 Tmax,1 (°C) Tmax,2 (°C)
5 mg/mL 72.57 ± 0.52 83.06 ± 0.09
10 mg/mL 71.83 ± 0.29 82.98 ± 0.05
15 mg/mL 72.13 ± 0.23 83.17 ± 0.11
20 mg/mL 71.88 ± 0.01 82.99 ± 0.08
30 mg/mL 71.91 ± 0.12 83.10 ± 0.03
50 mg/mL 71.93 ± 0.08 83.20 ± 0.02
100 mg/mL 71.85 ± 0.01 83.01 ± 0.01

在 100 mg/mL 浓度下,可清晰观察到两个转变,分别对应于 CH2 结构域在平均 Tmax,1 为 71.85 °C 时的解折叠,以及 Fab 和 CH3 结构域组合在平均 Tmax,2 为 83.01 °C 时的解折叠[2]。随着蛋白质浓度的降低,稳定性未发生显著的变化,并可观察到量热仪之间极佳的重现性。当 Herceptin 曲妥珠单抗的浓度为 20 mg/mL 时,CH2 解折叠转变的幅度显著降低,并在三个重复样品中观察到出色的重现性 (图 3)。浓度低于 20 mg/mL,对较小的 CH2 解折叠结构域的分析变得更具挑战性,检测到的 Tmax,1 的变异性也会增加。较大的解折叠事件 [如 Fab 和 CH3 结构域组合 (Tmax,2)] 更易于检测,在浓度低至 5 mg/mL 时也是如此。与所有 DSC 仪器一样,更尖、更窄的波峰可提供最高的重现性。检测限取决于样品,并且可能因蛋白质的复杂性和溶液环境而发生变化。

Figure 3. Triplicate thermograms of Herceptin Trastuzumab in PBS buffer at 20 mg/mL.
Figure 3. Triplicate thermograms of Herceptin Trastuzumab in PBS buffer at 20 mg/mL.

浓度依赖性热稳定性研究

TA Instruments RS-DSC 专为处理高浓度生物药物样品而设计,尤其适用于抗体药物和抗体药物共轭物。随着抗体疗法的日益成功,制药行业对可实现皮下和眼部给药的高浓度剂型越来越感兴趣。因此,50 – 150 mg/mL 的抗体浓度非常常见,有些甚至高于 200 mg/mL[3]。高浓度配制蛋白质会增加蛋白质对物理不稳定性的敏感性[4, 5]。相反的情形是,有研究表明,浓度增加时热稳定性会增强[6]。因此,了解在感兴趣的制剂浓度下的热解折叠以及对溶液环境的响应是减轻药品责任的关键指标。

TA Instruments RS-DSC 的设计允许在一次性微流控芯片中容纳蛋白质样品。传统的微量热仪包含一个固定的样品池,需要在两次实验之间进行清洁。高浓度样品在解折叠过程中容易发生沉淀或凝胶化,轻则难以清洗,重则可能会损坏样品池。TA Instruments RS-DSC 使用一次性微流控芯片,提高了操作简便性并摒除了耗时的清洗程序,可对高浓度蛋白质样品进行无风险测试。

为证明测试高浓度蛋白质样品的能力,并说明在所需配方浓度下进行测试的重要性,我们对甘氨酸缓冲液中 30 – 330 mg/mL 的鸡蛋清溶菌酶进行了评估 (图 4 和表 2)。 溶菌酶在低浓度 (~1 mg/mL) 时具有简单的单一转变热图,通常用作 DSC 的参考测试样品。通过对浓度高达 100 倍的蛋白质进行评估,我们观察到溶菌酶稳定性的浓度依赖性。

Figure 4. Short term thermal stability of lysozyme at concentrations from 30 to 330 mg/mL in glycine buffer, data in triplicate. Inset: Average Tmax relative to lysozyme concentration.
Figure 4. Short term thermal stability of lysozyme at concentrations from 30 to 330 mg/mL in glycine buffer, data in triplicate. Inset: Average Tmax relative to lysozyme concentration.

表 2. 溶菌酶浓度依赖性筛选中的转变温度和重现性。平均值 ± SD,n = 3。

浓度 Tmax (°C)
330 mg/mL 68.14 ± 0.05
300 mg/mL 69.00 ± 0.04
280 mg/mL 69.22 ± 0.04
260 mg/mL 69.19 ± 0.09
210 mg/mL 69.08 ± 0.06
160 mg/mL 68.39 ± 0.04
110 mg/mL 66.27 ± 0.09
70 mg/mL 64.68 ± 0.05
30 mg/mL 62.81 ± 0.06

在最低测试浓度 30 mg/mL 下,检测的溶菌酶 Tmax 为 62.81 °C。当浓度增加至 160 mg/mL,稳定性线性增加 (参见图 4 插图),Tmax 达到 68.39 °C。在 210 – 280 mg/mL 范围内,热稳定性趋于平稳,Tmax 约为 69.2 °C。有意思的是,在浓度为 300 mg/mL 时,在 80 °C 左右开始观察到主要转变尾部存在肩峰,主要转变的整体稳定性略有下降,Tmax 为 69.00 °C。在最高浓度 330 mg/mL 时,主要转变的热稳定性进一步降低, Tmax,1 降至 68.14 °C,并观察到一个额外的波峰,Tmax,2 为 80.28 ± 0.04 °C。凭借高浓度测试的能力,TA Instruments RS-DSC 可以在溶菌酶浓度大于约 300 mg/mL 时观察高阶结构的形成。除证明在高蛋白质浓度下获取高质量数据的能力外,本研究还证明了在目标浓度下测试生物药品的重要性,因为稀释可能会改变观察到的蛋白质稳定性。

结论

传统的单样品 DSC 技术准确度高,但需要大量样品,在药物开发过程中是一项耗时的技术。TA Instruments RS-DSC 可同时分析多达 24 个样品,实现了更高通量的热稳定性测试。更简单的工作流程、通过并行测试提高数据采集速率以及通过自动峰值检测算法加速分析,显著缩短了获得结果的时间。在此,我们展示了对低至 20 mg/mL 的复合多重转变抗体样品的准确、可重复的分析。2°C/分钟的较快扫描速率会产生更高振幅的信号,有助于在检测限或接近检测限的情况下分析样品。在研究高达 330 mg/mL 的高浓度溶菌酶溶液时,意外揭示了热稳定性与浓度的相关性,并强调了评估感兴趣药品浓度的重要性。总之,TA Instruments RS-DSC 提供了一个用于表征生物药物稳定性的全新平台,这是了解热应力耐受性、产品质量以及支持监管审批的重要变量。

参考文献

  1. “Standard Practice for Calibration of Fixed-Cell Differential Scanning Calorimeters,” ASTM E2603-15, 2023.
  2. K.J. Arlotta, A. V. Gandhi, H.-N.Chen, C. S. Nervig, J. F. Carpenter and S. C. Owen, “In-Depth Comparison of Lysine-Based Antibody-Drug Conjugates Prepared on Solid Support Versus in Solution,” Antibodies, vol. 7, p. 6, 2018.
  3. R.G. Strickley and W. J. Lambert, “A review of formulations of commercially available antibodies,” Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 110, pp. 2590-2608, 2021.
  4. J.Zarzar, T. Khan, M. Bhagawati, B. Weiche, J. Syndow-Andersen and S. Alavattam, “High concentration formulation developability approaches and considerations,” MAbs, vol. 15, pp. 1-13, 2023.
  5. S.J. Shire, Z. Shahrokh and J. Liu, “Challenges in the development of high protein concentration formulations,” Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 93, pp. 1390-1402, 2004.
  6. C.Zhang, J. W. Bye, L. H. Lui, H. Zhang, J. Hales, S. Brocchini, R. A. Curtis and P. A. Dalby, “Enhanced Thermal Stability and Reduced Aggregation in an Antibody Fab Fragment at Elevated Concentrations,” Molecular Pharmaceutics, vol. 20, pp. 2650-2661, 2023.

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